LC-MS/MS 蛋白质鉴定
技术介绍
IP/Pull-down，重组表达的蛋白，亚细胞器分离提取的蛋白质样品等可以以蛋白溶液混合物，或者SDS-PAGE电泳分离考马斯亮蓝或银染染色后切取目蛋白条带进行LC-MS/MS分析鉴定蛋白成分和比较不同组的相对蛋白质成分含量。在蛋白质定性分析之外, 还可以进一步深度分析位点氨基酸突变、翻译后修饰、化学修饰等。随着高灵敏度的LC-MS/MS出现，可以鉴定到含量为亚pg到ng级别的蛋白质，一般银染或者考染肉眼可见条带样品即可得到很好鉴定；结合高效液相色谱LC分离与高扫描速度的质谱检测特征，在一个条带或者混合溶液样品中，可以一次鉴定上百至上千个蛋白质成分。
酶切后的混合多肽样品先经过液相色谱（LC）分离，被逐渐洗脱下来，进入质谱的离子源被离子化，质量分析器检测。纳升液相色谱分离与离子源（Nano-ESI LC-MS/MS）更是将检测灵敏度提高了十倍，特别适合分析极低含量的珍贵的生物蛋白质样品。
IP/Pull-down实验流程如下：
分析仪器
Q-Exactive plus nano-ESI LCMS/MS Thermo Fusion nano-ESI LCMS/MS
应用范围
IP/pull down溶液；SDS-PAGE蛋白条带；亚细胞器蛋白质组，多肽/蛋白粉末。
样品要求
样品类型 | 样品要求（每组） |
蛋白胶条 | 考染、质谱兼容银染，条带清晰可见 |
磁珠/琼脂糖珠子溶液 | 总蛋白量>5ug |
蛋白质溶液 | 浓度>0.5ug/ul，蛋白质总量>10ug |
动物细胞样品 | 细胞量>106 |
细菌等微生物 | 细菌总重量>10mg |
植物组织样品 | 新鲜组织>100mg |
动物组织样品 | 新鲜组织>5mg |
血清 | 200ul |
唾液 | 300ul |
尿液 | 1ml |
1. 蛋白胶条：切取SDS-PAGE条带装入EP管内，ddH2O洗两次，然后吸走液体即可，无需封口膜密封。样品准备过程中需佩戴手套和头套，尽量避免角蛋白（keratin）对样品的污染。 2．珠子与蛋白溶液：请告知溶液内成分，如SDS、NP40、Triton、缓冲盐等。 3．蛋白胶条可常温运输，蛋白溶液必须干冰运输； |
参考文献
1）.Zhu, S., Wang, JZ., Chen, D. et al. An oncopeptide regulates m6A recognition by the m6A reader IGF2BP1 and tumorigenesis. Nat Commun 11, 1685 (2020),（客户文章）
2）.He, HP., Luo, M., Cao, YL. et al. Structure of Epstein-Barr virus tegument protein complex BBRF2-BSRF1 reveals its potential role in viral envelopment. Nat Commun 11, 5405 (2020)，（客户文章）
3）.Pan, Yihui et al. “EHBP1L1 Drives Immune Evasion in Renal Cell Carcinoma through Binding and Stabilizing JAK1.” Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany), e2206792. 12 Feb. 2023.（客户文章）