蛋白质/抗体全长测序

单克隆抗体结构：抗体是具有4条多肽链的对称结构，形状类似于“Y”的结构，分子量约150kDa。Ig分子的结构包括两个二硫键连接的两半相同的糖蛋白，由两条相同的50kDa的重链（Height Chain）和25kDa的轻链（Light Chain）组成，通过在轻链羧基末端附近的二硫键连接在一起。轻链有κ和λ两种，重链有α、δ、γ、ε和μ五种。一个抗体分子上的两个抗原结合部位是相同的，位于两臂末端称抗原结合片段（antigen-binding fragment, Fab）。”Y”的柄部称结晶片段（crystalline fragment, FC），糖结合在FC 上。整个抗体分子可分为恒定区（C区）和可变区（V区）两部分。在给定的物种中，不同抗体分子的恒定区都具有相同的或几乎相同的氨基酸序列。可变区位于“Y”的两臂末端。在可变区内有一小部分氨基酸残基变化特别强烈，这些氨基酸的残基组成和排列顺序更易发生变异区域称高变区（hypervariable region，HVR）。高变区位于分子表面，最多由17个氨基酸残基构成，少则只有2～3个。高变区氨基酸序列决定了该抗体结合抗原抗原的特异性。Fc区含有所有的免疫球蛋白共有的蛋白质序列及各个类别独有的决定簇，且在相同类别的不同Ig分子上没有显著变化。

由于抗体的Fab的CDR区域氨基酸具有高可变性，不能通过普通蛋白质组数据库比对的方式得到准确序列，因此需要基于高质量的LC-MS/MS图谱进行de novo从头测序拼接。主要步骤是通过多种蛋白酶酶切，比如trypsin，chymotrypsin，Glu-C，pepsin, elastase等（4-7种），然后进行HCD和EThCD碎裂模式的LC-MS/MS分析，软件辅助鉴定FR区域部分氨基酸，延申交叉覆盖可变区域氨基酸，从而逐步得到整个蛋白氨基酸序列长度，再与ESI-LCMS还原切糖后的轻、重链完整蛋白分子量相对比，理论序列计算分子量与质谱检测分子量范围二者相差需要在1-3Da之内。抗体测序难点是由于需要蛋白质序列100%准确，要求极高；并且需区分I与L氨基酸，因此需要分析人员极富经验，人工检查每一个氨基酸的二级质谱图，确保每一个氨基酸准确无误。

不同抗体类型：

                                                          

  参考文献

1). Peng, Weiwei et al. “Mass Spectrometry-Based De Novo Sequencing of Monoclonal Antibodies Using Multiple Proteases and a Dual Fragmentation Scheme.” Journal of proteome research vol. 20,7 (2021): 3559-3566.

2). Ma, Bin, and Richard Johnson. “De novo sequencing and homology searching.” Molecular & cellular proteomics : MCP vol. 11,2 (2012)